Trockennährböden - Zubereitung von eigenen Trockennährböden (allgemein)
Zubereitung
Lösen des Trockennährbodens
Zur Nährbodenzubereitung ist sauberes, frisch destilliertes oder vollentsalztes Wasser zu verwenden,
das möglichst neutral reagieren soll.
Die gründlich gereinigten Ansatzgefäße (meistens Erlenmeyer-Kolben) sind sorgfältig mit mit vollentsalztem
Wasser nachzuspülen, um eventuelle Rückstände anderer Substanzen (z.B. Spülmittelrückstände) restlos
zu entfernen. Die Ansatzgefäße sollten so groß sein, daß der angesetzte Nährboden gründlich umgeschüttelt
werden kann. Nach Möglichkeit nicht mehr als 1 - 2 Liter pro Gefäß ansetzen. Zu etwa der Hälfte der
erforderlichen Wassermenge die abgewogene Trockennährbodenmenge zusetzen und durch ausgiebiges
Schütteln homogen suspendieren. Danach die restliche Wassermenge zugeben, wobei gleichzeitig die der
Innenwand des Gefäßes anhaftenden Bestandteile abgespült werden.
Jeder Nährboden ist hitzeempfindlich! Er darf daher nicht mehr als unbedingt nötig erhitzt werden!
Nährmedien ohne Agar-Agar oder Gelatine sind meistens bereits in kaltem Wasser oder bei leichter Erwärmung lösbar. Im Sinne einer schonenden Zubereitung empfielt es sich, hiervon Gebrauch zu machen.
Agar oder Gelatine enthaltende Nährböden müssen hingegen zum Auflösen erhitzt werden. Das Erhitzen erfolgt im siedenden Wasserbad oder im strömenden Dampf (z.B. Autoklav ohne Überdruck oder Dampftopf). Bei Nährböden, die keiner nachfolgenden Autoklavierung unterzogen werden, ist unbedingt auf vollständige Auflösung zu achten. Sie ist daran zu erkennen, daß beim Umschütteln keine Agar-Partikel mehr an der Innenwand des Gefäßes haften und die viskose Lösung glatt abfließt.
Manche Nährböden weisen eine obligate Trübung auf (z.B. Bismut-Sulfit-Agar u.a.). Bei diesen ist durch möglichst feines Verteilen der unlöslichen Anteile für eine gleichmäßige Trübung zu sorgen.Sind Ansätze von agar- oder gelatinehaltigen Nährböden von mehr als 2 Litern pro Gefäß unumgänglich, so empfiehlt sich die folgende schonende Art des Auflösens:
- Trockennährboden in ca. 1/10 der vorgesehenen Wassermenge anschlämmen und 15 Minuten quellen lassen.
- Restliche Wassermenge zum Sieden erhitzen.
- Angeschlämmten Nährboden dem siedenden Wasser unter Rühren zusetzen.
- Bis zum Auflösen weiter erhitzen.
Einstellen des pH-Wertes
Trockennährböden von Merck weisen bei Verwendung von neutralem Wasser nach der Zubereitung bei einer Temperatur von +25 °C den angegebenen pH-Wert auf. Trotzdem empfiehlt es sich, vor allem bei älterer Ware, eine Überprüfung und gegebenenfalls eine Korrektur vorzunehmen.
Der pH-Wert ist von der Zusammensetzung des Nährbodens, von der Temperatur des Nährbodens während der Messung sowie von der Behandlung des Nährbodens beim Ansetzen (lösen, sterilisieren) stark abhängig. Deshalb sollte die Messung möglichst erst nach der Sterilisaion durchgeführt werden. Sie erfolgt am besten mit einem pH-Meßgerät (Temperaturkompensation beim Eichen der Elektrode beachten) oder mit Spezialindikatorstäbchen pH 4,0-7,0 (Merck, Art. Nr. 9542) und pH 6,5-10,0 (Merck, Art. Nr. 9543).
Messung und eventuell erforderliche Korrektur des pH-Wertes erfolgen bei festen und flüssigen Nährböden bei +15 °C. Der pH wird bei Bedarf auf den angegebenen Wert Eingestellt. Der Originalansatz ist während der Messung Ies pH-Wertes für evtl. Korrekturen flüssig zu halten. Die korrektur erfolgt durch Zugabe von 1 N oder 1/10 N Salzsäure oder Natronlauge zu einer genau abgemessenen Nährbodenprobe (z.B. 50 ml). Die Menge an Korrekurlösung für den gesamten Ansatz ergibt sich aus der Menge an Korrekturlösung für die Nährbodenprobe.
Durchführung einer pH-Korrektur
- Nährbodenansatz sterilisieren.
- Probe steril entnehmen und schnell auf +25 °C abkühlen
- pH-Wert der Probe messen und ggf. durch Titration auf korrekten Wert einstellen.
- Bei Bedarf die aus dem Titer errechnete Menge an Salzsäure bzw. Natronlauge dem Ansatz steril zugeben. (Salzsäure und Natronlauge können durch Glasfilter oder spezielle Membranfilter sterilfiltriert werden).
Sterilisation
Vor dem Sterilisieren sollte der Nährboden nach Möglichkeit in kleinere Portionen, beispielsweise in die endgültigen Untersuchungsgefäße (ausgenommen Petrischalen), abgefüllt werden.
Wenn in der Zubereitungsvorschrift nichts anderes vermerkt ist, so erfolgt die Sterilisation im Autoklaven über 5 Minuten bei +121 °C. Aufheiz- und Abkühlzeiten, abhängig vom Gerätetyp und vom Ansatzvolumen, sind nicht eingerechnet. Sie sind beim Gerätehersteller zu erfragen. Sterilität ist nur dann zuverlässig zu erzielen, wenn der Dampfraum und die Gefäße einwandfrei entlüftet wurden. Zu diesem Zweck wird zu Beginn der Aufheizphase der Autoklav bei geöffnetem Ventil ausgiebig mit strömendem Dampf durchspült. Nach der Sterilisation und nach erfolgtem Druckausgleich sollten zur Verminderung der Hitzebelastung des Nährbodens die Gefäße sofort aus dem Autoklaven genommen und rasch abgekühlt werden, z.B. auf Gießtemperatur. Hier empfiehlt sich kaltes, fließendes Wasser.
Höhere Temperaturen und längeres Erhitzen als vorgeschriebenen schaden der Qualität des Nährbodens!
Das Autoklavieren ist die sicherste Art der Sterilisation von Nährböden. Steht ein Autoklav nicht zur Verfügung, so kann als Notbehelf ein Druckkochtopf, wie er im Haushalt Verwendung findet, eingesetzt werden.
Platten gießen
Um die Kondenswasserbildung im Deckel der Petrischalen weitgehend zu vermeiden, sollten die Nährmedien bei möglichst nicht mehr als +45 °C bis +55 °C zu Platten gegossen werden. Zuvor ist das Ansatzgefäß gut umzuschwenken, um eine gleichmäßige Durchmischung des Nährbodens zu gewährleisten. Luftblasen in der Platte werden durch kurzes Befächeln mit der entleuchteten Bunsenbrennerflamme entfernt. Vor dem Beimpfen können feuchte Agar-Oberflächen, die das Schwärmen von Mikroorganismen bzw. das Zerfließen von Kolonien begünstigen würden, im Brutschrank bei +30 °C bis +40 °C getrocknet werden. Dazu wird der Bodenteil der Petrischale mit der Innenseite nach unten auf den daneben liegenden Deckelteil seitlich aufgesetzt. Die Trocknungszeit beträgt ca. 20-30 Minuten, in Brutschränken mit Luftumwälzung entsprechend weniger.
Schrägagarröhrchen
Für bestimmte Anwendungsgebiete in der Mikrobiologie hat es sich als sinnvoll erwiesen, Oberflächenzüchtungen in Kulturröhrchen durchzuführen (z.B. für die Stammhaltung). Für diesen Zweck wird eine große Nährbodenoberfläche benötigt, die man mittels "Schrägagar" erzielen kann. Dazu werden die mit dem sterilisierten, noch flüssigen Agarnährboden befüllten Röhrchen in eine derartige Schräglage gebracht, daß über einer bis ca. 3 cm langen Hochschicht eine mindestens ebenso lange Schrägfäche entsteht. In der festgelegten Position läßt man den Nährboden erstarren.
Saure Nährböden
Agar-Nährböden mit einem pH-Wert unter 6,0 müssen besonders schonend zubereitet werden, da beim Erhitzen in saurem Milieu Agar-Agar hydrolisiert und somit die Gelstabilität des Nährbodens abnimmt. Eine Wiederverflüssigung ist deshalb möglichst zu vermeiden. Ist eine entsprechende Zubereitungsweise nicht möglich oder eine Wiederverflüssigung unvermeidbar und somit eine Verringerung der Gelstabilität erfahrungsgemäß zu erwarten, so kann man eventuell dem Nährboden vor dem Auflösen Agar-Agar (Merck, Art. Nr. 1614) zugeben. Im allgemeinen reichen ca. 5,0 g/Liter für diesen Zweck aus.
Zusammensetzung der Nährböden
Einige Nährbodengrundsubstanzen weisen als Naturstoffe gewisse chargenabhängige Eigenschaftsschwankungen auf. Diese müssen in den Trockennährböden fallweise durch Anderungen der Mengenverhältnisse ausgeglichen werden, um reproduzierbare Ergebnisse bei der Kultivierung von Mikroorganismen zu erhalten. Daher werden für die Trockennährböden "typische" Zusammensetzungen deklariert.